【摘要】 目的 研究产超广谱β内酰胺酶(ESBLs)菌株整合子分布以及在ESBLs基因水平转移中的作用。方法 采用PCR方法检测产ESBLs和非产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的整合酶基因,分析整合子在产TEM、CTX和SHV型ESBLs菌株中的分布及经质粒转移的情况。结果 产ESBLs菌株中blaTEM、blaCTX 和blaSHV基因检出率分别为58.2%、74.7%和32. 9%；产ESBLs菌同时具有≥1种的ESBLs基因, bla SHV+ CTX基因检出率为12.9%、blaCTX+TEM为9.8%、 blaSHV +TEM为8.7% 和 blaSHV+ CTX+ TEM为5.2%。结论 产ESBLs菌株中blaTEM、blaCTX 和blaSHV基因与整合子具明显相关性；整合子携带着1个以上的多个耐药基因盒,与宿主菌的多重耐药性密切相关。
【关键词】 耐药基因 超广谱β内酰胺酶 整合子
【Abstract】 Objective To study the distribution of class Ⅰintegron in extended-spectrum beta-lactamases (ESBLs)-producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae and its contribution in horizontal transfer of ESBLs genes.Methods The presence of class Ⅰintegron among ESBLs-producers and non-ESBLs-producers of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae were detected by polymer asechain reaction(PCR).The correlation and co-transfer between integron and genes coding for SHV, CTX and TEM were studied.Results The positive rate of blaTEM、blaCTX and blaSHV was 58.2%、74.7%、32. 9% respectively; bla SHV+ CTX、blaCTX+ TEM、 blaSHV +TEM and blaSHV+ CTX+ TEM was 12.9%、9.8%、8. 7%、5.2% respectively. Conclusion The positive rate of blaTEM、blaCTX and blaSHV was related with class Ⅰintegron;The integron with antibiotic resistance gene cassette contributes to multidrug resistance in ESBLs-producing strains.
【Key words】 antibiotic resistant gene; ESBLs; integron
ESBLs是导致革兰阴性菌对β-内酰胺类抗菌药物耐药的重要机制。质粒、转座子和整合子对耐药基因在细菌间的水平转移起着重要作用。整合子可特异性地俘获和表达外源基因盒,并以质粒或转座子为载体在细菌间移动,导致耐药基因的快速和广泛播散。整合子可携带对氨基糖苷类、喹诺酮类、磺胺等耐药基因盒。整合子大致可分为Ⅳ类,其中Ⅰ类在捕获和表达耐药基因中最常见。因此本文通过研究产ESBLs菌株中Ⅰ类整合子的分布和性质,明确菌株的播散趋势,有效监控细菌耐药。由于肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌是临床最常见的产ESBLs菌,其中CTX-M、SHV和TEM是最常见的ESBLs型别，本文对我院2006年肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌的临床分离株,检测Ⅰ类整合子在产TEM、CTX和SHV型ESBLs菌株中的分布,明确Ⅰ类整合子在产ESBLs肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌的流行和播散中的临床意义。
1 材料与方法
1.1 菌株来源 281株肺炎克雷伯菌和201株大肠埃希菌均为我院临床标本中分离并按全国统一操作规程〔1〕。标本主要包括血液、尿液、痰和其他分泌物。
1.2 仪器试剂 VITEK-2型全自动微生物分析仪、ID-GN 鉴定卡、AST-GN09药敏卡由法国Bio-Merieux公司生产; VITEK 比浊计(V 1210) 由日本生产；PCR扩增仪为美国PERKIN ELMER公司9600型基因扩增仪；日本三洋MDF型超低温冰箱;德国Hettich公司22R型低温超速离心机;美国水套式恒温培养箱。
1.3 菌种鉴定、药敏 所有实验菌株分离纯化后按VITEK-2的使用要求配制成菌悬液和稀释液, 分别填充到ID-GN和AST-GN09卡中, 用VITEK-2仪器自动完成细菌的鉴定和药敏试验。
1.4 质控菌株 由卫生部临床检验中心提供的标准菌株大肠埃希菌(ATCC 25922)、铜绿假单胞菌(ATCC 27853) , 药敏质控结果符合NCCLS 药敏质控要求。
1．5 超广谱β内酰胺酶（ESBLs）检测 按照NCCLS 2000年版推荐的纸片扩散表型确证法进行检测。用肺炎克雷伯菌 ATCC700603为阳性对照，大肠埃希菌 ATCC2592为阴性对照。
1.6 耐药基因的检测 采用碱裂解法和蛋白酶K法提取被测细菌的质粒和染色体基因,提取方法根据不同引物设立不同PCR条件；以ATCC700603肺炎克雷伯菌和TEM-26型大肠埃希菌分别作SHV型和TEM型阳性对照。
1．7 质粒接合转移 将产ESBLs菌株和大肠埃希菌培养到对数生长期,按6：1（v/v）接种,37℃培养,用含头孢噻肟(1μg/ml)的培养基筛选接合菌,制备模板用于PCR扩增。
1.8 PCR耐药菌基因〔2〕 根据GenBank公布的Ⅰ类整合子整合酶基因和blaSHV、blaCTX和blaTEM基因序列，采用Primer软件设计引物(表1)。反应体系均为25μl,其中缓冲液2.5μl,10mmol/L 4×dNTP 0.5μl,50μmol/上下游引物各1μl,DNA多聚酶0.25μl,DNA模板1μl,超纯水18.75μl 。根据不同引物设立不同PCR反应条件。以ATCC700603肺炎克雷伯菌作SHV型阳性对照，以TEM-26型大肠埃希菌作TEM型阳性对照,产物经电泳,在紫外线下观察结果,并在凝胶上成像。
1.9 DNA序列分析〔3〕 PCR扩增的基因片段经电泳后,切下相应条带纯化,进行DNA测序,结果在GenBank序列数据库进行同源性分析(BLASTN)。
1．10 统计学处理〔2〕 细菌耐药性分析用 WHONET5软件进行分析，耐药率差异有显著性，用SPSS10.0统计软件分析,两组耐药率比较应用χ2检。表1 用于检测耐药基因的引物
2 结果与分析
2．1 ESBLs检出结果及耐药率 281株肺炎克雷伯菌和201株大肠埃希菌共检出ESBLs 194株，占40.３%,非产ESBLs细菌为288株占59.7%。产ESBLs 的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对抗生素的平均耐药率为74.1%,明显较非产ESBLs株平均耐药率47.9%高(P0.05)。产ESBLs的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌除头孢替坦外，对其他头孢类抗生素的耐药率均在90%以上；对β内酰胺和碳青霉烯类如氨苄西林、氨曲南和哌拉西林的耐药率为100%，仅对美洛培南和亚胺培南二种抗生素未产生耐药；产ESBLs的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对多种抗生素耐药率明显高于非产ESBLs菌株(P0.05)(表2)。表2 产ESBLs和非产ESBLs菌对抗生素的耐药率
2．2 产ESBLs菌株的PCR检测 对13株产ESBLs菌株(其中8株大肠埃希菌和5株肺炎克雷伯菌)的PCR产物测序，其中blaTEM阳性的扩增产物为TEM-1基因, blaCTX阳性的扩增产物为CTX-M-3基因,而blaSHV阳性的扩增产物则分别为SHV-1、SHV-5、SHV-11和SHV-12。blaTEM、blaCTX和blaSHV基因的PCR琼脂凝胶电泳如图1～3。图1 TEM基因PCR扩增电泳图图2 SHV基因PCR扩增电泳图(1： DNA分子量标志,2000bp梯带；