作者：刘涛 马龙 赵军 苏德奇
【摘要】 目的研究琐琐葡萄多糖（VVP）在体外对大鼠免疫性肝损伤的保护作用。方法采用热水提取、乙醇沉淀，Sevage法除蛋白、透析分离纯化提取VVP，苯酚硫酸法测定多糖含量。采用BCG整体致敏，LPS离体攻击法建立大鼠原代肝细胞免疫损伤模型，取细胞上清液测定其ALT，AST活性和NO含量。结果琐琐葡萄中多糖含量为8.19％；VVP 5，20，80μg/ml均可程度不同地使BCG+LPS损伤后升高的大鼠肝细胞上清ALT，AST活性和NO含量明显下降，其作用与阳性对照药物甘立欣（Grz）相似。结论VVP在体外对大鼠免疫性肝损伤具有明显的保护作用。
【关键词】 琐琐葡萄； 多糖； 肝细胞； 免疫性肝损伤
Abstract：ObjectiveTo study the effect of polysaccharide isolated form Vitis viniferal on immunological liver injury model in vitro.MethodsVitis amurensis Polysaccharide was obtained by extracting with water, precipitation with 95% ethanol, clearing protein with the sevage assay, and dialyzing and phenol - sulphate colorimetry was used to determine its content. The immunological hepatotoxicity model was induced by Bacillus Calmette Guerin (BCG) plus lipopolysaccharides (LPS) in vitro. The supernatant of cells after 3～24 h incubation with VVP were taken for the estimation of ALT, AST and NO respectively. ResultsThe content of polysaccharide in Vitis amurensis was 8.19％. Elevated ALT, AST activities and NO level were decreased after treatment with VVP (5，20，80 μg/ml) in different doses. The effects of VVP mentioned above were similar to those of the standard drug, Dinmmonium Glycyrrhizinate (Grz) . ConclusionVitis viniferal polysaccharide shows significant protective effects against immunological liver damage induced by BCG plus LPS in vitro.
Key words：vitis viniferal; Polysaccharide; Hepatocyte; Immunological liver injury
琐琐葡萄为葡萄科葡萄属植物琐琐葡萄Vitis viniferal L.的成熟果实，主产于新疆吐鲁番、和田、鄯善等地，是维吾尔医习用的一种药食兼用植物，药用果实，具有健脾胃、理肺、生津、养血等作用。维医用于治疗脾胃不和、神志不安等，民间用于小儿麻疹、肝炎等症〔1〕。琐琐葡萄中除含有大量的葡萄糖、果糖、维生素、氨基酸等营养成分外，还有鞣质类、黄酮、萜类、多糖等多种生物活性物质〔2～4〕。研究表明多糖（polysaccharides）具有增强免疫、抗氧化、抗肿瘤、降血脂、抗衰老、抗辐射等多方面的药理作用〔5〕，是近年来天然药物研究的热点课题之一。为探讨多糖与琐琐葡萄抗病毒免疫调节活性的相互关系，本研究采用热水提取、乙醇沉淀，Sevage法除蛋白、透析分离纯化提取了琐琐葡萄多糖（VVP），苯酚硫酸法测定多糖含量，并采用BCG整体致敏，LPS离体攻击法建立大鼠原代肝细胞免疫损伤模型，探讨了VVP在体外对大鼠免疫性肝损伤的保护作用。
1 器材
1.1 动物SD大鼠，雄性，体重（200±20）g，新疆医科大学实验动物中心提供（SPF级，动物使用许可证号：SYXK〔新〕2003-0001）。
1.2 药材 琐琐葡萄购自新疆维吾尔自治区吐鲁番维药市场，经专家鉴定为Vitis viniferal L.的果实。
1.3 仪器与试剂 UV2501PC型双光束紫外分光光度计（日本岛津）；SaBa18 AMS全自动生化分析仪（Roma-Italy）；Forma二氧化碳培养箱；XD 711型酶标仪（上海迅达医疗器械有限公司）；DZ K88-A型电热恒温真空干燥箱(上海医疗器械七厂)；CQ-50型超声波清洗器(上海超声波仪器厂) ；METTLER TOLEDO AB104-N型分析天平(Mettler-Toledo Instr.shanghai Ltd)。甘立欣（Grz，江苏正大天晴药业股份有限公司，批号060808）；Ⅳ型胶原酶、LPS（E coli 0555:B5）（Sigma公司）；DMEM培养基（GIBCO公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司，批号061205）；卡介苗（BCG，上海生物制品检定所，批号0601001）；谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）试剂盒（中生北控生物科技股份有限公司），N-萘基-乙烯二胺、对氨基苯磺酰胺（Fluka进口分装）。其余试剂均为国产分析纯。
2 方法
2.1 VVP的提取及含量测定 琐琐葡萄药材300 g，粉碎，过40目筛，加10倍体积的水回流提取3次，3 h/次，提取液合并后减压浓缩至适量，再加入5倍体积的 95% 乙醇，静置过夜。抽滤，沉淀经无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，置60 ℃真空干燥箱中干燥，得粗多糖。将粗多糖溶于水，以Sevage法除蛋白，透析，透析液中加入5倍体积的95%乙醇，静置过夜，抽滤，所得沉淀用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤数次，置60 ℃真空干燥箱中干燥，即得精制多糖。以半乳糖为对照品，采用苯酚-硫酸法〔6〕测定琐琐葡萄中多糖的含量为8.19％。
2.2 大鼠原代肝细胞培养方法〔7〕采用两步灌流法取大鼠原代肝细胞进行培养。取SD雄性大鼠6只，随机分为两组，模型组经尾静脉注射BCG 8 mg/只致敏，正常组经尾静脉注射等体积生理盐水。第12天分别取正常和BCG致敏的大鼠，腹腔麻醉，酒精消毒后开腹，分离肝门静脉并行门静脉插管，以37℃无钙灌流液灌流肝脏，迅速剪断下腔静脉，作在位灌流5 min，边灌流边切断肝与周围组织的联系，将肝移置无菌托盘内继续灌流。冲尽残血后，换为37℃ Ⅳ型胶原酶灌流液循环灌流10 min。取出肝脏转移至超净工作台中进行无菌操作。
撕去肝包膜后将肝在培养液中轻轻振摇，散落肝细胞，收集细胞悬液，500 r/min，离心3 min，弃上清液，向沉淀中加入含20%胎牛血清的DMEM培养液同条件重复清洗两次，最后用DMEM培养液重悬细胞。用0.4%等张台?蓝溶液染色，计算细胞活率，细胞活率在90%以上者可用于实验。