作者：黄益玲， 黄利鸣，惠燕 ，鲁华
【关键词】 天花粉蛋白；,,HeLa细胞；,,细胞凋亡
摘要：目的研究天花粉蛋白(TCS)对人宫颈癌HeLa细胞生长的抑制作用, 探讨TCS抗肿瘤的作用机制。方法采用MTT法检测TCS对Hela细胞的抑制作用，形态学观察、DNA电泳及流式细胞仪检测TCS对HeLa细胞的诱导凋亡作用。结果TCS对HeLa细胞的生长具有明显的抑制作用，显微镜下可见细胞圆缩，胞浆凝聚等凋亡细胞的形态学改变，DNA凝胶电泳呈梯级格局，流式检测出现凋亡峰，凋亡比例具有剂量和时间依赖性。结论 天花粉蛋白通过诱导细胞发生凋亡而抑制宫颈癌HeLa细胞的增殖。
关键词：天花粉蛋白； HeLa细胞； 细胞凋亡
Experimental Study of Trichosanthin's Effect on Hela Cells Proliferation
Abstract：ObjectiveTo study the inhibitory effect of trichosanthin(Tcs) on Hela cells and its anti-tumor mechanism.MethodsThe antiproliferative effect of TCS on Hela cells was measured with MTT assay. Light microscopy was used to observe the morphology changes , DNA agarose electrophoresis and FCM analysis were carried out to examine the induced apoptosis.ResultsThe proliferation of HeLa cells was significantly inhibited by TCS, Hela cells showed a serial of characteristic changes of apoptosis such as cell volume shrinkage , chromatin condensation; the occurrence of DNA ladder and apoptosis rate of Hela cells was dose and time dependent. Conclusion Trichosanthin can inhibit the proliferation of Hela cells by its induction of apoptosis.
Key words： Trichosanthin; Hela cell; Proliferation
宫颈癌是导致妇女死亡的第二大原因，严重威胁女性身体健康。天花粉蛋白（Trichosanthin,TCS）是从葫芦科植物栝楼（Trichosanthin kirilouii Maxim）的块根中提取出来的一种单链核糖体失活蛋白(ribosome - inactivating protein , RIP)，具有多种生物学效应，主要包括免疫调节、抗肿瘤、抗病毒等作用〔1〕 。目前，TCS的抗肿瘤研究主要集中在绒毛膜上皮癌、胃肠道肿瘤和白血病等方面〔2～3〕。本实验研究TCS对人宫颈癌HeLa细胞生长的抑制作用，并从诱导细胞凋亡的角度探讨其抗癌作用，为药物的进一步研究开发提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 试剂 MEM培养基和胎牛血清（FBS）购自美国GIBCOBRL公司，碘化丙啶（Propidium Iodide ，PI）及RNase A (RNA酶)为Simga公司产品，噻唑蓝(MTT)购自Amresco公司。二甲基亚砜(DMSO)购自Fluka公司，TCS购自上海金山制药厂（纯品，规格为1.2 mg/ml）。
1.2 细胞培养人宫颈癌HeLa细胞为本室传代保存,培养于5%CO2，37℃湿化孵箱中。培养基MEM含10%FBS，0.1 U/L青霉素，0.1 U/L链霉素，取对数生长期细胞待用。
1.3 细胞生长抑制实验采用噻唑蓝(MTT)还原法进行检测:将Hela细胞接种于 96 孔细胞培养板内(每孔的细胞数为2×104个)，细胞贴壁后对照组换新鲜培养基，实验组换用含有不同浓度TCS的培养基，置 CO2 培养箱内分别培养 24 ，48，72 h ，去上清，加入 MTT 溶液200 μl/孔，置 CO2 培养箱内培养 4 h，去上清，每孔加入200 μl DMSO ，轻度振荡后，测定 570 nm 处光吸收值。取8孔吸收值平均数，按公式细胞抑制率(%)=(1-实验组平均吸光度值/对照组平均吸光度值)×100%计算药物对细胞生长的抑制作用。
1.4 细胞凋亡的检测
1.4.1 细胞形态学观察 将处于指数生长期的Hela细胞以不同浓度的TCS处理后，倒置显微镜下观察Hela细胞的形态改变。
1.4.2 DNA琼脂糖凝胶电泳 胰蛋白酶消化收获实验组及对照细胞, 1 000 r/min离心5 min,PBS清洗细胞两遍, NP40溶液作用细胞沉淀,加入SDS(终浓度1%)及RNase(终浓度2 μg/μl)，56℃处理2 h，蛋白酶K(终浓度2 μg/μl)37℃作用3～5 h， 加入1/10体积的3M醋酸钠及2倍体积的无水乙醇，轻轻振摇后置于-70℃冰箱中过夜, 14 000 r/min离心15 min，弃上清，用冰冷的 70％乙醇漂洗，1.2% 琼脂糖凝胶30 V电泳3～5 h，紫外观察拍照。
1.4.3 流式细胞仪检测分别离心收集对照组及实验组细胞，以含0.2%FBS的PBS清洗后加入75%冰冷的乙醇固定, 在10 000 r/min条件下离心5 min，去乙醇，PBS洗涤两次，弃上清；用0.5 ml PBS重悬，加入等体积的细胞裂解缓冲液室温作用5 min，加Rnase A (终浓度30 μg/ml)置37℃水浴中消化30 min，离心后再加人1m1 PI染色(终浓度50 μg/ml)避光染色30 min，以300目尼龙网滤过，上流式细胞仪检测， Multicycles 软件分析结果。
1.5 数据统计分析用 SPSS 10.0 for windows统计软件包作ANOV方差分析。