【摘要】 目的研究叠鞘石斛的快速繁殖及离体开花的培养体系。方法选用野生的叠鞘石斛带侧芽的茎段作为外植体，培养在附加不同激素的培养基上。结果MS培养基附加6-BA（1.0 mg・L-1），NAA（0.5 mg・L-1）对侧芽的诱导效果最佳。而MS培养基附加6-BA（2.0 mg・L-1），NAA（0.4 mg・L-1）最适合丛生芽的增殖。把无菌苗培养在附加6-BA（2.0 mg・L-1）的MS培养基中，少数植株被诱导开花，诱导率为10.0%。结论用带腋芽的茎段作为外植体在MS培养基中，附加一定的6-BA和NAA可以诱导丛生芽的产生。
【关键词】 叠鞘石斛； 组织培养； 花芽诱导
Abstract：ObjectiveTo study rapid propagation and in vitro flowering system for Dendrobium denndanum.MethodsStem with lateral buds of wild denndanum was used as explants and cultured on various culture media with different portions of hormone.ResultsThe best medium for lateral buds induction was the MS with addition of 6-BA (1.0 mg・L-1),NAA (0.5mg/L), while MS with the addition of 6-BA (2.0 mg・L-1),NAA (0.4 mg・L-1) was suitable for the cluster shoots propagation. A few plantlets were induced flowering after cultured on MS medium with addition of 6-BA (2.0 mg・L-1), the frequency of floral bud induction was 10.0%.ConclusionThe cluster shoots can be induced from the segments with lateral buds on the MS basic medium with addition of 6-BA and NAA.
Key words：Dendrobium denndanum; Tissue culture; Induction of floral buds
石斛是常用名贵中药材，属兰科（Orchidaceae）石斛属Ddendrobium。现已发现，该属有很多种类具有药用价值，其中铁皮石斛、金钗石斛、霍山石斛等药用价值很高，价格昂贵。石斛中含有多种生物碱、抗癌菲、类黄酮等物质，具有抗衰老、增强机体免疫力等作用〔1〕，其应用范围较广，需求量不断增加。但近年来由于受过度采伐、生长缓慢、繁殖率低等因素的影响，使石斛的野生资源严重枯竭，我国已将其列为濒危药用植物〔2〕，为挽救石斛属的植物物种，扩大药源，前人已对多种石斛属的植物进行了组织培养快速繁殖的研究〔3～6〕，但对叠鞘石斛的组织培养目前尚未见报道。本文报道了叠鞘石斛茎段在不同激素配比培养基中出芽、发育成苗的过程，同时初步进行了离体开花的诱导。
1 材料与方法
1.1 材料供试材料叠鞘石斛Dendrobium denndanum采于贵州省紫云县，并经贵州大学生命科学学院植物学教研室鉴定为叠鞘石斛。标本种植于贵州大学植物标本地。
1.2 材料处理与接种选取生长健壮、无病虫害感染的茎段，将其截成长1～1.5 cm的带芽茎段，用流水冲洗1 h，在超净工作台用75%的酒精消毒30 s，再用0.1%的HgCl溶液消毒12 min，无菌水冲洗5次。将此茎段接种于芽启动培养基上。每个配方接种10瓶，每瓶接种5段，22～24℃，光照12 h/d，光强度2 000 lx条件下培养。
1.3 培养基
1.3.1 芽启动培养基①MS+6-BA 1.0mg・L-1+NAA 0.5 mg・L-1+2%蔗糖+0.8%琼脂；②MS+6-BA 1.0mg・L-1+ NAA 1.0 mg・L-1+2%蔗糖+0.8%琼脂；③1/2MS+6-BA 1.0 mg・L-1+NAA 0.5 mg・L-1+2%蔗糖+0.8%琼脂；④1/2MS+6-BA 1.0 mg・L-1+NAA 1.0 mg・L-1+2%蔗糖+0.8%琼脂。
1.3.2 芽增殖培养基①MS+NAA 0.4 mg・L-1+ 不同浓度6－BA（单位同前） +2%蔗糖+0.8%琼脂；②MS+NAA 0.4 mg・L-1+ 不同浓度KT（单位同前） +2%蔗糖+0.8%琼脂； ③MS+NAA 0.4 mg・L-1+ 不同浓度ZT（单位同前）+2%蔗糖+0.8%琼脂。
1.3.3 生根培养基 ①MS+6-BA 2.0 mg・L-1+NAA 0.4 mg・L-1 +2%蔗糖+0.8%琼脂；② MS+6-BA 1.0 mg・L-1+NAA 0.4 mg・L-1 +2%蔗糖+0.8%琼脂；③ MS+6-IBA1.5 mg・L-1+NAA 0.4 mg・L-1+2%蔗糖+0.8%琼脂。
1.3.4 成花诱导培养基① MS+6-BA 2.0 mg・L-1+NAA0.5 mg・L-1 +2%蔗糖+0.8%琼脂；② MS+ ABA 0.5 mg・L-1+2%蔗糖+0.8%琼脂；③ MS+2－4D 0.1 mg・L-1+6-BA0.5mg・L-1+2%蔗糖+0.8%琼脂；④ MS+6-BA 2.0 mg・L-1+2%蔗糖+0.8%琼脂；上述培养基pH均为5.8。
2 结果
2.1 启动培养外植体培养30 d后，茎节部的侧芽开始萌动，与培养基接触的部位逐渐形成乳白色的瘤状突起，以后突起逐渐膨大，颜色由白转绿（见图1），大约40 d以后芽开始伸长， 60 d后形成丛生状小苗。几种诱导启动培养基均能诱导芽的萌发(见图2)，其中以培养基①和③中产生的芽多。培养基① 和③ 所含的激素浓度相同而基本培养基不同，分别是MS培养基和1/2MS培养基，说明基本培养基对叠鞘石斛芽的萌发影响不大，6-BA和NAA的浓度对芽的萌动和发育有一定影响，当6-BA在1.0 mg・L-1，NAA在0.5 mg・L-1时对芽的萌发生长最有利。此外，选择靠近茎尖的茎节端，通常容易诱导芽的萌发，这可能与茎尖主要由具有胚性的分生细胞构成，其分裂能力高于茎段的其它部位。
2.2 丛生芽的增殖培养 把无菌苗从茎上切下转接到增殖培养基中培养。大约10 d左右，在原来萌发的芽周围开始产生不定芽,进而形成丛生芽，连续转接2～3次，可以不断增加丛生芽的数量。常用的细胞分裂素有KT，ZT，6-BA，将这3种激素及不同浓度配比的增殖培养基对芽的增殖进行比较（见表1）。结果表明，6-BA的对丛生芽的增殖效果最明显，平均芽增殖倍数为7.3倍，其中当浓度为2.0 mg・L-1时，形成较多的丛生芽，形成的丛生芽最多、且长势好（见图3），芽的增殖倍数最高，为9.0倍。从表中看出，6-BA影响芽增殖的3个实验浓度中，芽的增殖倍数与6-BA质量浓度成正相关。KT和ZT对芽的增殖也有一定的作用，但效果较6-BA稍差。相同激素不同质量浓度的差异性比较，P值大于0.05，而不同激素组合相同质量浓度的显著性分析，P值大于0.05。KT质量浓度的不同对芽增殖的影响无明显的影响。而ZT的两个实验浓度对芽的倍增数也无显著的影响。