【摘要】 目的: 制备人核迁移蛋白（hNudC )的单克隆抗体（mAb）并鉴定其特性。方法: 从人胎肝组织中克隆得到 hNudC 基因, 构建重组表达质粒 pET?28b/hNudC, 表达带有6?His标记的重组hNudC, 用纯化的重组 hNudC 蛋白免疫 BALB/c小鼠制备mAb, 用ELISA筛选抗体阳性的细胞克隆, 用免疫荧光染色法及Western blot 试验鉴定 mAb 的特异性。结果: 获得2株杂交瘤细胞系2C16和2D8, 其分泌的mAb的 Ig亚类(型)分别为IgG1 和IgM(κ) , 杂交瘤细胞培养上清的ELISA效价分别为1∶64和1∶32; 腹水mAb的效价分别为1∶1×105和1∶5×104。mAb与重组hNudC蛋白有较强的特异性反应, 免疫荧光染色和Western blot试验证明, 制备的 mAb 可以识别人巨核系白血病细胞株 Dami、 Meg?01和人脐带血来源的CD41＋巨核细胞中表达的 hNudC 蛋白。结论: 成功地制备了特异性抗 hNudC mAb, 为研究 hNudC 蛋白的功能、 天然分布及异常表达奠定了基础。
【关键词】 人核迁移蛋白; 单克隆抗体; 巨核细胞
人核迁移蛋白C 基因(human nuclear distribution C, hNudC), 定位于第1号染色体1p34?p35, 编码331个氨基酸, 基因全长为8 kb。NudC进化上保守, 从构巢曲霉、 果蝇、 小鼠等生物均能找到同源物, 人类 NudC羧基末端的94个氨基酸与构巢曲霉的同源性为67%, 与果蝇的同源性为76%, 与大鼠的同源性为98%。NudC的C?末端12个氨基酸, 在所有的种类中都被保留〔1〕。hNudC在人体组织中广泛表达, 提示hNudC具有重要的生物学功能〔2〕。早期的生物学活性的研究表明, hNudC与其家族成员(包括胞质动力蛋白、 肌动蛋白、 LIS1和NUDE)相互作用, 和微管一起参与细胞增殖〔3〕、 正常的造血〔4〕、 神经细胞形成等。近期研究进一步证明, hNudC在促进造血细胞生长中起着功能性作用〔5〕。这些资料为 hNudC的功能研究提供了新的方向。
为了进一步研究hNudC蛋白的结构与功能, 探索hNudC对于造血细胞的增殖、 分裂的功能和影响, 迫切需要hNudC的特异性抗体, 但现在并无相应市售抗体。为此, 本研究拟用纯化的重组hNudC蛋白为免疫原, 利用经典的淋巴细胞融合技术, 建立稳定分泌特异性单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株, 并对得到的mAb进行鉴定, 检测hNudC蛋白在人巨核细胞中的表达情况和亚细胞定位, 为进一步探讨hNudC蛋白的结构和功能提供工具。
1 材料和方法
1.1 材料 弗氏完全佐剂购于Sigma公司。蛋白表达载体pET28b(+) 购自Invitrogen公司; 工具酶购自MBI Fermentas公司; 质粒DNA提取试剂盒和琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒购自Omega公司; 亲和层析柱TALON Spin Column购自CLONTECH公司; Dynal CD34 祖细胞分选系统 Prod.No. 113.01购自 Dynal Biotech, Norway公司。造血干细胞无血清培养液StemSpan H2000购自Stem Cell Technologies公司; 淋巴细胞分离液Ficoll?PaqueTM Plus (1 077 g/L)购自Amersham Biosciences公司。IMDM (Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium)培养基粉末: 购自Gibco公司; 胎牛血清FBS购自Gibco公司。重组人的rhTPO购自于Sigma公司。FITC 标记的CD41 mAb、 藻红蛋白（PE）标记的二抗兔抗鼠?IgG（H+L）、 FITC 标记的二抗兔抗鼠?IgG（H+L）等抗体购自于Southern Biotechnology Associates公司。BALB/c小鼠和健康成年雄性Wistar大鼠由中山大学实验动物中心提供。白血病巨核细胞系Dami、 Meg?01购自中国科学院上海细胞库。其他化学试剂购自Sigma 公司。
1.2 方法
1.2.1 外源基因蛋白的表达和纯化 将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3), 挑取单个克隆接种于LB/Kan (50 mg/L)培养液中, 37℃培养过夜。取上述过夜菌液按比例接种于新鲜的LB/Kan培养液, 剧烈振荡, 37℃培养2～3 h至A600为0.5～0.6, 加异丙基硫代B?D?半乳糖苷（IPTG）至终浓度为0.5 mmol/L, 30℃继续继续剧烈振荡培养3 h 。离心收集菌体沉淀, 超声波破碎细胞壁后, 常规TALON Metal Affinity Resin 亲和柱进行蛋白纯化, 最后用FPLC System色谱仪进一步纯化表达产物。电泳鉴定目的蛋白的相对分子质量（Mr）和表达产量。透析过夜, BioRad法测定蛋白质浓度后, -80℃保存备用。
1.2.2 杂交瘤细胞的建立 用0.5 mL纯化的hNudC 蛋白(1.7 g/L)与等量福氏完全佐剂混合并完全乳化后, 经腹腔注射免疫BALB/c小鼠(0.1 mL/只) 。加强免疫时, 用福氏完全佐剂充分乳化抗原, 注射剂量和部位同前, 共免疫4次, 每次间隔2周。最后1次直接用抗原溶液进行免疫。末次免疫后3 d, 取脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0在PEG4000作用下融合。用间接ELISA法筛选mAb分泌阳性的杂交瘤细胞。经3～4次有限稀释法克隆化后, 选择2株mAb分泌持续阳性的杂交瘤细胞扩大培养, 并按常规制备腹水。
1.2.3 mAb的效价测定 采用间接ELISA法。用hNudC (1 mg/L)包被聚苯乙烯板。一抗为适当稀释的杂交瘤细胞培养上清或腹水样本, 二抗为1∶3 000的HRP－羊抗鼠IgG, 经TMB底物显色后, 于波长450 nm测定A值。
1.2.4 Ig亚类(型)的鉴定 参照试剂盒中的说明书进行。用PBS将杂交瘤细胞培养上清进行10倍稀释, 取150 μL滴加到测试管中, 使蓝色胶乳完全重悬。将抗体测定试纸条的黑色一端插入到试管的底部, 待蓝色的阳性控制线条出现时, 取出测试条, 2 min后读取结果。
1.2.5 抗血清反应特性的Western blot 分析 将hNudC 蛋白进行 SDS?PAGE分离, 电转移到硝酸纤维素(NC) 膜上, 在封闭液中37℃缓慢摇动2 h , 用洗涤液洗3次, 与10-3稀释的 hNudC mAb 在37℃孵育1 h , 用洗涤液洗3 次, 每次15 min; 与适当稀释的兔抗鼠 IgG?HRP 在37℃孵育1 h , 用洗涤液洗3 次, 每次15 min; BCIP/NBT显色液中显色数分钟, 待目标条带显色清晰时, 将NC膜转移到PBS 中停止显色, 拍照记录结果。
1.2.6 人脐血来源的巨核细胞CD41+培养 每份脐血均取自广东省造血干细胞库。选择年龄在24～35 岁的足月妊娠健康产妇, 无肝炎、 结核等各种妊娠并发症, 样品经正式同意后来自足月分娩的胎儿。在无菌条件下采集样品, 脐血平均采集量为50～80 mL, 4℃冰箱存放。免疫磁珠分离法体外分离脐血中CD34+细胞, 无血清液体培养体系中加入50 μg/L TPO促进 CD41+巨核细胞生长, 37℃、 50 mL/L CO2条件下共同培养, 每3～4 d半量换液1 次, 培养8 d后收集CD41+细胞。
1.2.7 白血病巨核细胞系的培养 白血病巨核细胞系Dami、 Meg?01均用含100 mL/L小牛血清DMEM培养基常规培养。细胞置于37℃孵箱中, 在50 mL/L CO2条件下培养。
1.2.8 hNudC蛋白在人巨核细胞的分布 培养收集人巨核细胞CD41+细胞, 调整细胞密度为1×105个/L; 取细胞混悬液, 滴入经过L?多聚赖氨酸处理后的玻璃载玻片上, 放入湿盒中孵育过夜贴壁, 用40 g/L多聚甲醛固定45 min; 与1∶1 000稀释后的hNudC mAb孵育1 h; 然后与1∶1 000稀释后的PE标记的二抗兔抗鼠?IgG孵育1 h; 用PBS缓冲液5 min×3次, 与1∶1 000稀释后FITC标记的CD41 mAb孵育1 h; PBS缓冲液5 min×3次, 与DNA核染料1 000 μg/L DAPI, 4℃孵育15～30 min。PBS缓冲液5 min×3次, 封片, 在荧光显微镜下观察计数, Nikon COOL PIX?4500数码相机摄影记录。
1.2.9 hNudC蛋白在白血病巨核细胞系的分布 Dami、 Meg?01细胞培养、 收集、 固定等方法同1.2.8, 与1∶1 000稀释后的hNudC mAb孵育1 h; 与1∶1 000稀释后的FITC标记的二抗兔抗鼠?IgG孵育1 h; 用PBS缓冲液5 min×3次, 与DNA核染料1 000 μg/L DAPI, 4℃孵育15～30 min。PBS缓冲液5 min×3次, 封片, 在荧光显微镜下观察计数, Nikon COOL PIX?4500数码相机摄影记录。
1.2.10 hNudC蛋白在人巨核细胞和白血病巨核系细胞株中的表达 收集对数生长期的人巨核细胞与Dami、 Meg?01细胞株, 在500 μL细胞裂解液（含Protease Inhibitor Cocktail）中快速匀浆。4℃抽提1.5 h, 4℃ 12 000 r/min离心15 min, 吸取上清提取人巨核细胞与Dami、 Meg?01细胞株的总蛋白分装-80℃冻存。制作蛋白质标准曲线, 测定所提取的蛋白浓度。使用Western blot 分析hNudC蛋白在人巨核细胞和白血病巨核系细胞株中的表达, 每组样品均重复2次。
2 结果
2.1 杂交瘤细胞株的建立 细胞融合后, 共有84个微孔有杂交瘤细胞克隆生长, 其中有12个微孔能够检测到抗体, 经3～4次克隆化培养后, 获得2株（2C16和2D8）可稳定分泌抗 hNudC mAb的杂交瘤细胞。将其体外连续培养1个月后液氮冻存, 复苏后仍能稳定分泌抗 hNudC mAb。