论文关键词：葡萄皮 花色苷 提取 稳定性研究
论文摘要 ：葡萄皮花色苷是一种天然色素，具有溶解性好、色彩鲜艳、易与食品结合上色等特点，是替代合成色素的一类重要食品添加剂。
本实验利用超声波辅助酸性乙醇溶剂法对葡萄皮花色苷的提取进行了研究，获得葡萄皮花色苷提取的最优工艺，并研究了花色苷对外界环境的稳定性。实验结果表明，葡萄皮中花色苷的最适提取条件为：提取温度60℃，提取液的乙醇浓度80%，提取液 pH 0.5。提取液的pH对花色苷提取率有显著性影响。稳定性实验结果表明，低温条件下的花色苷较为稳定，随着温度的升高葡萄皮花色苷降解速度加快，稳定性逐渐下降；避光保存时花色苷稳定性最好，当葡萄皮花色苷溶液处于光照条件下，花色苷降解速率加快；蔗糖、防腐剂、亚硫酸钠对葡萄皮花色苷的稳定性无明显影响；H2O2对葡萄皮花色苷的稳定性有较大影响。
Keywords: grape skin; anthocyanins; extraction; stability test
Abstract ：Anthocyanins are natural technicolored pigments and are bright-coloured, which can dissolve in water and combine with food easily. They are important food additives instead of artificial colour.
The anthocyanins were extracted from grape skin by ultrasonic wave and the stability of anthocyanins from grape skins were studied. The results showed the optimal temperature for extraction was 60℃, the concentration of ethanol was 80% and the pH was 0.5. The pH of extraction had significantly influence on the ratio of extraction. The stability test showed that anthocyanins from grape skins with low temperature were stable and the rate of degradation was rapid when temperature was high. Light affected the stability of anthocyanins from grape skins and it was stable when anthocyanins were out of light. Glucose, aseptic, Na2SO3 had little influence on the stability of anthocyanins from grape skins;while H2O2 had great influence on the stability of anthocyanins from grape skins.
1 绪 论
1.1 花色苷的概述
花色苷是自然界中最庞大的一类水溶性色素，日常生活中人们食用的被子植物和开花植物中，至少有27个科，73个属和很多个种的植物中含有花色苷类物质[1]。花色苷广泛存在这些植物的花、果实、茎、叶和根等器官的细胞液中，使其呈现由红、紫红到蓝等不同的颜色。
1.1.1 花色苷的化学结构以及种类
在花色苷属于黄酮类化合物[8] [9] [10]，由花色苷配基（花色素）和糖基以糖苷键结合形成。花色苷配基（花色素）具有黄酮类物质的C6C3C6 结构[11]，是2-苯基-苯并吡喃阳离子的衍生物。花色素很不稳定，所以在食品中和植物中主要以花色苷的形式存在。
花色素因为3、5位上的取代基的差异而有不同的种类。目前已知的花色素有二十余种，在食品中重要的有六种[11] [12] [13]，即花翠素（飞燕草素）、花青素（矢车菊素）、3＇-甲花翠素（矮牵牛色素）、甲基花青素（芍药色素）、二甲花翠素（锦葵色素）[2] [3]。不同种类的花色苷因花色素结构的不同而带有不同的颜色。
1.1.2 花色苷的性质 1.1.2.1 花色苷的基本物理化学性质
花色苷一般可溶于水、甲醇、乙醇、丙二醇、丙三醇、冰醋酸、柠檬酸等极性溶剂，不溶于苯、甲苯、氯仿、石油醚、四氯化碳、油脂等非极性溶剂，在溶液中，其溶解度随温度的升高而加大。花色苷能被活性炭吸附，与醋酸铅试剂沉淀[20] [21] [22]。
1.1.2.2 花色苷的光谱学性质
通过紫外-可见光谱法可以对花色苷进行定性[5]。花色苷最大吸收波长一个在可见光区的 500～540nm 处，另一个在紫外 275nm 处，通过测定花色苷提取物的最大吸收波长即可判断是否为花色苷类物质。向花色苷的 0. 01 %盐酸甲醇溶液中滴加 3～5 滴 AlCl3 甲醇或乙醇溶液，会出现蓝移，即最大吸收波长增加。通过花色苷最大吸收波长处的吸光度和440nm 处的吸光度的比值（A440/Amax）可以判断出糖苷的位置。酰化的花色苷一般在 300～330nm 间有吸收峰。如果花色苷在 440nm 处没有肩峰，则花色苷的 5 号位的羟基没有被取代。
1.2 花色苷研究进展 1.2.1 花色苷的生理活性研究进展 1.2.1.1 消除自由基、抗氧化作用
在各种有关衰老的学说中，自由基学说得到越来越多的认同。自由基是生物体氧化过程中产生的中间代谢产物，当机体清除自由基能力下降或体内自由基生成过多时，过剩的自由基在体内堆积，作用于生物膜多不饱和脂肪酸，使之发生脂质过氧化而引起膜结构和功能紊乱，攻击蛋白质引起蛋白质交联，酶活性改变，损伤DNA引起突变，从而引起细胞的破坏、衰亡，最终导致机体的衰老和功能障碍。
1.2.1.2 抗诱变作用
许多文献报道，花色苷有很强的抗突变作用[17]。目前国外在这方面已有比较深入的研究报道。Yoshimoto[6]等用鼠伤寒沙门氏菌TA98对四种不同颜色甘薯根的水提物进行了抗突变的试验，证明了紫色甘薯中的花色苷对于杂环胺类的致突变的物质具有很好的抑制作用，特别是从紫色甘薯中分离的两种花色苷：矢车菊色素-3-(6，6-咖啡酰阿魏酰槐糖苷)-5-葡萄糖苷(YGM-3)和芍药素-3-(6，6-咖啡酰阿魏酰槐苷)-5-葡萄糖苷(YGM-6)具有很强的抗突变作用，YGM-3抗突变作用大YGM-6。
1.2.1.3 降血脂的作用
国外已有文献报道，黄酮类物质具有较强的降低血脂血糖作用。Suda[7] [23]等进行了含大量花色苷的紫色甘薯饮料的生理功效试验研究。结果表明，给大鼠喂食含大量花色苷的紫色甘薯饮料后，病鼠血清中谷氨酸-草醋酸转氨酶（GOT）、谷氨酸-焦葡萄糖酸转氨酶（GPT）的上升受到明显地抑制，而且紫甘薯饮料表现出对病鼠血清中的硫化巴比妥酸（TBA）反应物、肝脏中的TBA反应物及氧化脂蛋白的增加均有一定的抑制能力。Matsui等给约两月大的雄性小鼠口服2g/kg麦芽糖和1从紫色甘薯块根中分离出来的一种二酰基花青素，结果表明30分钟后小鼠体内的血糖浓度下降了16.5%，二酰基花青素是通过对α-葡糖苷酶产生抑制作用，从而导致血糖的降低。
1.2.2 花色苷的测定方法研究进展
目前为止花色苷的定量分析方法主要有直接比色法、pH示差法、亚硫酸脱色法、色谱法[24]。
1.2.2.1 直接比色法
花色苷的最大吸收区在 500～550nm 内，花色苷总量可以用比色法通过适当波长处的吸光度来测定[25]。该方法测定花色苷总量需要在一个恒定的 pH介质中进行。因为单个花色苷的比消光度很难得到，一般用平均比消光度来测定花色苷总量，其方法可用于定量测定花色苷含量。但也可以用吸光值间接测定花色苷含量。这种方法比较适合测定新鲜植物中的花色苷含量，因为在新鲜植物提取物中很少存在花色苷最大吸收区内的干扰物质[26]。
1.2.2.2 pH示差法
在含有干扰物质的体系中，花色苷总量的测定，可采用 pH 示差法。这种方法确定两个对花色苷吸光度差别最大但使花色苷稳定的 pH 值，根据 Fuleki 公式可计算花色苷总量，但 pH 示差法需要缓冲静置较长的时间，比较复杂费时。在这基础上经过改良也可以用单 pH 测定法。冯建光等[27]曾用 pH 示差法测定葡萄皮花色苷的总量。黄?等[28]分别用直接比色测定法、pH 示差法、单 pH 测定法三种不同的方法测定了黑豆种皮花色苷的含量，结果表明单 pH 测定法是三种方法中最适宜用来测定黑大豆皮提取液中花色苷总含量的方法。
1.2.2.3 差减法[29]
通过先测定样品在可见光区最大吸光值，经二氧化硫或亚硫酸盐漂白或过氧化氢氧化后，再测定吸光值，得出两次吸光值的差值。再通过公式算出花色苷总量。
1.2.3 花色苷的提取研究进展 1.2.3.1 溶剂浸提法
国内关于葡萄色素提取方面报道最多的是溶剂提取法，如马海燕等[30]分别用1%盐酸甲醇、5%盐酸甲醇、5%盐酸乙醇、60%丙酮水溶液法、醋酸甲醇水溶液、pH为1.0的酸水溶液等溶剂对葡萄皮的花色素进行了提取方面的研究。
1.2.3.2 微波辅助萃取法
微波萃取则是利用微波能来提高萃取效率的一种较新技术。微波是一种频率300～300 000 MHz的电磁波。在微波场中吸收微波能力的差异使得基体物质的某些区域或萃取体系中的某些组分被选择性加热，从而使得被萃取物质从基体或体系中分离，进入到介电常数较小、微波吸收能力相对较弱的萃取剂中。由于传统提取过程中能量累积和渗透过程以无规则的方式发生，萃取的选择性较差，只能通过改变溶剂性质或延长溶剂萃取时间来获得，同时又受限于溶解能力和扩散系数，效果不够理想；微波因其能对萃取体系中不同组分进行选择加热，因而能使目标组分直接从基体分离萃取。微波萃取受溶剂亲和力的限制较小，可供选择的溶剂较多。另外，微波加热则利用分子极化或离子导电效应直接对物质进行加热，避免了传统加热过程因热传导、热辐射造成的热量损失，加热效率高、升温快速均匀，缩短了萃取时间。具有设备简单、适用范围广、重现性好、萃取效率高、萃取时间短、能耗低、污染轻等特点。
1.2.3.3 酶解法
酶是一种生物催化剂，具有高效性、专一性等特点。在天然食用色素提取生产中，由于天然色素一般在高温、强酸、强碱发生变化或分解，而酶催化反应条件温和，一般在较低温度、接近中性的条件下就能进行，所以酶解法非常适合于天然食用色素的提取与精制[31]。目前为止已经有了用酶解法辅助提取花色苷的报道。
1.2.3.4 超高压辅助提取法
超高压技术是近年来引起广泛关注的“高新技术”之一[32] [33]。超高压技术最初应用于食品保鲜、品质改良、安全控制、乳化和成型等方面，并由此推动了相关生物技术的基础研究。随着超高压技术应用范围的逐渐扩展和技术发展的日趋成熟，已经有学者将超高压技术应用于中药等天然产物的提取中。与传统的煎煮、回流等提取方法相比，超高压技术辅助提取技术具有时间短、能耗低、溶剂消耗少、杂质成分溶出少、收率高、环保等优点。另外，超高压技前葡萄皮天然色素已经有了应用的报道，国外将植物葡萄(V. vinifera)、美洲葡萄(V.labrusea)等葡萄科果实的果皮(制造葡萄汁或葡萄酒后的残渣)，除去种子，用水萃取后经精制、真空浓缩而得。其葡萄皮色素呈宝石红，发色基团为花色苷。
1.4 本课题研究的意义
色素是食品中重要的添加剂, 随着人类对合成色素毒性作用认识的深人和对天然绿色食品的渴求, 天然色素的需求量日益增大。葡萄皮色素来源较为丰富。葡萄果皮花色苷不但含量高, 而且种类多, 葡萄花色苷作为一种天然食用色素, 安全、无毒，且具有降低肝脏及血清中脂肪含量、抗氧化、抗肿瘤、延迟血小板凝集等多种生理和药用活性功能, 在食品、化妆品、医药领域有着巨大应用潜力。所以对葡萄皮花色苷的提取技术及稳定性的研究具有重要意义。目前对于花色苷提取工艺的报道多数为热水浸提法和溶剂浸提法，应用超声波辅助提取花色苷的研究报道较少，尤其是葡萄皮里的花色苷。花色苷在甲醇和乙醇中溶解度大，所以一般采用酸性甲醇和酸性乙醇为提取溶剂。但甲醇毒性较大，考虑到食用色素的安全性问题，本研究采用酸性乙醇作为提取剂结合超声波进行辅助提取，对葡萄皮花色苷的提取技术及稳定性的研究具有重要意义。
1.5 本文主要研究的内容
葡萄皮花色苷为天然色素，采用单因素轮换实验和正交试验相结合的方法研究不同因素即温度、pH值和提取液的乙醇浓度对葡萄皮花色苷提取的影响。并确定本试验各个因素中对结果起到显著影响的因素以及试验范围内的各因素和水平的最佳条件；然后对葡萄皮花色苷在不同条件下的稳定性进行研究，测定温度、光照、蔗糖、防腐剂、还原性物质、氧化性物质对葡萄皮花色苷的稳定性的影响。